Forschungsprogramm des SFB 535
Invasionsmechanismen und Replikationsstrategien von Krankheitserregern
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Zusammenfassung


Infektionserreger stellen nach wie vor eine erhebliche Bedrohung der Gesundheit von Mensch und Tier dar. Aus diesem Grund ist die Thematik des Sonderforschungsbereichs  seit seiner Planung und Genehmigung im Jahr 1996 aktuell geblieben. 
Der SFB widmet sich im Gesamtkonzept in allen Teilprojekten der molekularen Erforschung von Krankheitserregern. Die Auseinandersetzung mit dem Wirtsorganismus und die Verwendung von Wirtszellfaktoren spielen dabei wichtige Rollen, das Hauptgewicht liegt jedoch auf den Erregereigenschaften:
A)   Welche Mechanismen hat ein Erreger entwickelt, um sein Opfer zu erkennen und in den Wirt einzudringen, d. h. welche  Invasionsmechanismen und Oberflächenstrukturen verwendt der Erreger hierfür.
B)   Im infizierten Wirtsorganismus muss der Erreger für seine Vermehrung sorgen, was im Allgemeinen unter mehr oder weniger starker Einbeziehung von Wirtskomponenten erfolgt oder zumindest eine spezifische Anpassung des Erregers an die Umgebung im Wirt erfordert, d. h. er verfolgt eine bestimmte Replikationsstrategieund steuertentsprechend seine Genexpression. In der Realität sind die Aspekte A und B eines Erregers kontinuierlich miteinander verknüpft, sie gehören als Einheit zum Lebenszyklus eines Erregers und sind somit aufeinander abgestimmt. Daher ist es naheliegend, dass bestimmte Erreger bzw. Erregergruppen sowohl in Teil A als auch in Teil B bearbeitet werden.


 
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Zusammensetzung des SFB 535

Ein wichtiger Themenbereich ist die Gruppe der Positivstrang-RNA-Viren. TP A18 untersucht den Eintritt von Pestiviren in die Wirtszelle, TP B1 den danach folgenden Vorgang der IRES-gesteuerten Translation des Virusgenoms, wie er bei den Pestiviren, dem Hepatitis-C-Virus und auch den Picornaviren vorliegt. Allen diesen Viren ist auch die Prozessierung eines Polyproteins durch viruscodierte Proteasen gemein. Die genaue Erforschung dieses Vorgangs bei Pathogenitätsvarianten der Pestiviren führte zur Identifizierung eines bis dahin unbekannten Wirtsfaktors (Jiv), der offensichtlich bei vielen Positiv-Strang-Viren eine Rolle spielt (B4). Die Entstehung der pestiviralen Pathogenitätsvarianten beruht ihrerseits auf der Rekombination der Virus-RNA untereinander oder mit zellulären mRNA-Molekülen. Wie TP B8 überraschend zeigen konnte, läuft dieser Prozess nicht immer – wie man bisher glaubte – bei RNA-Neusynthese durch "Template Switch" ab, sondern auch ganz ohne virale RNA-Replikation. Verblüffend ist auch die Beobachtung, dass das pestivirale Core-Protein für die Replikation und Morphogenese entbehrlich ist, was zur Formulierung eines neuen TP (B13) führte. Diese interessanten Befunde werfen Fragen auf, deren Beantwortung in der jetzt laufenden letzten Förderperiode zu einem geschlossenen Bild führen kann

In TP A18 (früher A1, T. Rümenapf, T. Krey) wurde mit bovinem CD46 bereits ein Rezeptor für ein Pestivirus nachgewiesen, jedoch muss es noch mindestens einen weiteren essentiellen Rezeptor geben, der identifiziert werden soll. Desweiteren hatten sich überraschende Einzelheiten im Eintrittsweg des Virus gezeigt, die zellbiologisch analysiert werden sollen.

TP B1 (M. Niepmann) hat eine Reihe von zellulären Faktoren identifiziert und charakterisiert, die bei der Cap-unabhängigen Initiation der Translation an die picornavirale 5'-terminale Interne Ribosomen Eintrittsstelle (IRES) binden und z.T. an der Attenuierung eines Poliovirus-Impfstamms beteiligt sind. Von besonderem Interesse ist die Verstärkung der Translationsinitiation bei Hepatitis-C-Virus durch die 3'-terminale Region der viralen RNA. Dadurch ergeben sich Hinweise auf die Regulation der viralen RNA-Transkription und -Replikation, die nunmehr detailliert untersucht werden sollen.

TP B4 (N. Tautz)hat mit der Entdeckung des Chaperon-Moleküls Jiv als Kofaktor der viralen Autoprotease NS2 aufgeklärt, wie die Bildung der für die Pathogenität wichtigen NS3-Protease bei bovinem Virusdiarrhöe-Virus (BVDV) reguliert wird, und dass das ungespaltene Vorläuferprotein NS2-3 durch Verbrauch des nur in geringen Mengen vorhandenen Jiv in der späten Replikationsphase überwiegt. Auch bei anderen Plus-Strang-Viren scheint Jiv eine Rolle zu spielen. Welche Rolle dieser ausgefeilte Regulationsmechanismus unter Einbeziehung viraler und zellulärer Faktoren im Lebenszyklus des Virus spielt und welche Strukturen beteiligt sind, soll nunmehr untersucht werden. TP B4 ist ein mustergültiges Beispiel dafür, dass mit einer langfristigen Förderung auch komplexe biologische Fragestellungen molekularbiologisch überzeugend gelöst werden können.

Auch TP B8 (P. Becher) hat in sehr überzeugender Weise mit molekulargenetischen Methoden ein Phänomen untersucht, das sich lange Jahre einer experimentellen Klärung entzogen hat: die RNA-Rekombination, die zur Erzeugung der vielfältigen natürlich vorkommenden Varianten von BVDV führt. Überraschenderweise kann die Rekombination zwischen zwei defekten BVDV-Genomen auch ohne virale RNA-Replikation ablaufen. Nunmehr gilt es zu klären, welche viralen und zellulären Faktoren dieses Ereignis ermöglichen.

Pestiviren gehören zu den umhüllten Viren. Bislang gilt die Lehrmeinung, dass die Virushülle der Pestiviren (und Vertretern der anderen Gattungen aus der Virusfamilie Flaviviridae) ein isometrisches Capsid bestehend aus dem Core-Protein umschließt und dass dieses Capsid für die Morphogenese unerlässlich ist. In TP B13 (T. Rümenapf/H.-J. Thiel) wird dieses scheinbar gesicherte Modell umgestoßen. Die Antragsteller haben eine Core-negative Variante erzeugt, die zur Bildung infektiöser Viruspartikel in der Lage ist und dabei eine Domäne des Nichtstrukturproteins NS3, deren Funktion bislang unklar war, als maßgeblich für die Morphogenese ermittelt. Die Aufklärung der tatsächlichen Funktion des Core-Proteins und von NS3 bei der Morphogenese gehört mit zu den interessantesten TP dieser letzten Förderperiode.
Die weitgehende Bündelung des Forschungspotentials eines Instituts auf  Pestiviren über viele Jahre hinweg war nur mit der Förderung im SFB möglich und hat zu einer weltweiten Spitzenstellung dieses Instituts auf dem Gebiet der Pestiviren geführt.

Auch das Thema Hepatitis-B-Virus (HBV) (Virusfamilie Hepadnaviridae) war Gegenstand der Förderung seit Beginn des SFB 535 und schon davor in den Vorläufer SFBs. Die Schwierigkeit, kein stetig verfügbares Zellkultursystem für dieses Virus zu haben, führte M. Kann (B5) zu dem neuartigen Ansatz, den intrazellulären Transport des HBV-Capsids mit permeabilisierten Zellen zu untersuchen und neuerdings auch mit Protein-transportierenden Lipiden und intakten Zellen. Er fand dabei heraus, dass der Transport von der Genomreifung innerhalb des Capsids abhängt und im Kernporen-Basket an der Innenseite der Kernmembran endet, wo das reife Capsid spontan zerfällt, das Genom freisetzt und überraschenderweise mit RNA wieder reassembliert. Quasi als Nebenbefund stellte M. Kann fest, dass HBV-Capside mit ca. 35nm Durchmesser durch die Kernpore hindurchtreten und deren Durchmesser somit größer als der im Lehrbuch mit 27nm angegebene ist. Die zellulären Partner bei Assembly, Transport und Disassembly der Capside sind Gegenstand der laufenden Förderperiode.

TP A2 (W. Gerlich, D. Glebe) erlebte in den letzten 3 Jahren einen Durchbruch mit einem praktikablen Zellkultursystem, das bereits viele wichtige Befunde lieferte. Überraschend war, dass das kleine Hüllprotein des HBV als Hauptkomponente der Virushülle und auch des Hepatitis-B-Impfstoffs nicht an der Bindung des Virus an die Zielzelle beteiligt ist, sondern nur die PräS1-Domäne. Ähnlichkeiten des kleinen Hüllproteins mit den Hüllproteinen anderer Viren (Retroviren und auch Pestiviren, TP A16) lassen eine Rolle bei Endozytose und Freisetzung des Capsids vermuten, was nunmehr näher untersucht werden soll. Mit der Identifizierung eines hochaffinen PräS1-Hüllproteinelements ist die Suche nach dem HBV-Bindungsrezeptor in ein viel versprechendes Stadium gelangt.
RNA-Minusstrang-Viren weisen bei aller Vielfalt der Replikationsmechanismen eine Reihe von Gemeinsamkeiten in der Struktur der Hüllproteine und den Invasionsmechanismen auf. So haben das Masernvirus (TP A17, A. Maisner), das Virus der Borna'schen Krankheit (BDV) (TP A3, W. Garten), die Filoviren (TP A13, S. Becker) und die Influenza-Viren (TP B12, S. Pleschka) die Eigenschaft, aus der Oberfläche der infizierten Zelle herauszusprossen (budding), und nach Bindung an eine neue Zielzelle die Virushülle mit zellulären Membranen (Plasmamembran bzw. Endosomenmembran) zu verschmelzen. Sprossung, Bindung und Membranfusion sind das Ergebnis fein regulierter Interaktionen zwischen den Komponenten der Virushülle und zellulären Komponenten (Proteine, Lipide).

In TP A17 (A. Maisner) wird der Sonderaspekt verfolgt, dass Masernvirus, wie auch einige andere umhüllte Viren, eine Fusion der infizierten Zelle mit Nachbarzellen auslöst und sich so im Prinzip auch ohne Freisetzung von Zelle zu Zelle verbreiten kann. Dennoch ist der Vorgang auf Dauer eine Sackgasse, da die Syncytien nicht lebensfähig sind und somit nicht als Virusreservoir dienen können. Welche viralen Faktoren das Gleichgewicht zwischen Zellfusion und Virusfreisetzung regeln, ist Gegenstand des neuen TP A17, das umfangreiche Vorarbeiten vorweisen kann.

TP A3 (W. Garten) über BDV ist von Anfang an am SFB beteiligt gewesen. Waren zunächst praktisch nur offene Leserahmen als Hüllproteinkandidaten bekannt, ist es vorwiegend der Arbeit dieses TP zu verdanken, dass Funktionen, Modifikationen und proteolytische Prozessierung dieser Proteine nunmehr weitgehend bekannt sind, und jetzt mit der Identifizierung der zellulären Partner und ihrer Rolle bei der Invasion begonnen werden kann.

TP A13 (S. Becker) verfolgt den Prozess der Virusreifung am Beispiel des Marburgvirus. In den letzten Jahren sind neue Strukturelemente der Zelle, die multivesicular bodies, und virale Peptidsequenzmotive (late domains) identifiziert worden, die virale Matrixproteine auf der Innenseite der Virushülle und die Virus-Oberflächenproteine auf der Außenseite letztlich zusammenführen und schließlich eine Sprossung der Viren auslösen. Die Regulation und die essentiellen Elemente dieses Vorgangs sind ein hochaktuelles Thema in der virologischen Forschung.

Filoviren als ein Marburger Schwerpunktthema sind auch Gegenstand von TP B9 (E. Mühlberger), hier mit dem Aspekt der Genomreplikation. Bereits 2001 hat E. Mühlberger mit der Generierung eines nur auf Nukleinsäure basierenden Systems zur Erzeugung von infektiösem Ebolavirus einen wesentlichen Beitrag zur Erforschung dieser hochgefährlichen Viren geschaffen. Kürzlich ist dies auch für das Marburg-Virus gelungen. Im TP B9 stehen die Erforschung der viralen Transkription und das Umschalten auf RNA-Replikation im Vordergrund, sowie die Replikationseffizienz als Pathogenitätsdeterminante.

Das Umschalten von Replikation auf Virusreifung bei Influenzaviren ist Thema von TP B12 (S. Pleschka). Ausgangspunkt dieses Projekts war die Beobachtung, dass ein Hemmstoff der Raf/MEK/ERK-Signalkaskade die Virusproduktion hemmt. Als gehemmter Teilschritt stellte sich der Export der viralen Ribonukleoproteine aus dem Zellkern zur Plasmamembran heraus. Die Aktivierungsmechanismen der zellulären Signaltransduktion durch das Virus und die viralen Zielmoleküle der zellulären Signalkaskade sind Hauptaspekte dieses TP.

Viele pathogene Bakterien suchen ähnlich wie Viren Strukturen der Zelloberfläche, um durch Anheftung ihren Lebensraum zu stabilisieren und um den Wirtsorganismus zu ihrem Vorteil zu beeinflussen. Verschiedene pathogene E.coli-Stämme besitzen ein Transportsystem, mit dem sie an Darmepithelzellen binden und bakterielle Proteine injizieren. Zusätzlich bedienen sich Bakterien unterschiedlichster Toxine, um ihren Lebensraum zu erhalten oder zu erweitern. Das Shigatoxin von enterohämorrhagischen E.coli-Stämmen ist ein Faktor, dessen Hauptfunktion mutmaßlich in der Unterdrückung der innate immunity liegt. In TP A11 (C. Menge, G. Baljer) konnte die Wirkung des Toxins auf die Aktivierung von Immunzellen in unterschiedlichen in vivo Systemen bis hin zum Tierversuch verfolgt werden.

Listeria monocytogenes ist ein äußerst vielseitiges Bakterium, das seine Pathogenität als intrazellulär wachsendes Agens entfaltet. TP B14 (T. Hain, T. Chakraborty) hat in umfangreichen Vorarbeiten mehrere induzierbare bzw. reprimierbare Gengruppen identifiziert, die an der Fähigkeit, intrazellulär zu wachsen und sich von Zelle zu Zelle zu verbreiten, beteiligt sind. Mit den modernen Methoden der DNA-Arrays sollen die Transkriptionsmuster in verschiedenen Zellkompartimenten von Säugerzellen umfassend analysiert werden, daneben aber auch in Zellen von Drosophila melanogaster, einem bekannten Wirt für L. monocytogenes.

Das Spektrum der untersuchten Parasiten umfasst Protozoen und Helminthen. Phosphorylcholin-modifizierte Glykokonjugate sind wesentliche Komponenten bei der Entwicklung von freilebenden Helminthen, wirken aber auch bei parasitären Würmern immunmodulatorisch auf den Wirt. Die an die Biosynthese beteiligten Enzyme sind somit wichtige Zielstrukturen für Anthelminthika. Diese Enzyme und ihre Gene werden zur Zeit in TP A8 (G. Lochnit) mit biochemischen Methoden und mit einem siRNA-Ansatz im Modellorganismus Caenorhabditis elegans ermittelt. Daneben werden in Immunzellen die Cytokinmuster untersucht, die durch die Phosphorylcholin tragenden Antigene induziert werden.

Als weitere Überlebensstrategie bedienen sich parasitäre Helminthen der molekularen Mimikry, indem sie auf ihrer Oberfläche Kohlenhydrat-Epitope exprimieren, die auch der Wirt aufweist. Schistosoma mansoni verfolgt diese Strategie sowohl im Zwischenwirt, der Süßwasserschnecke Biomphalaria glabrata, als auch beim Menschen. In TP A15 (R. Geyer) werden die entsprechenden Glykane bei Mensch, Schnecke und Wurm identifiziert. Daneben wird die Interaktion dieser Strukturen mit DC-SIGN und Toll-like Rezeptoren untersucht.

Die Schistosomen leben als "Pärchen-Egel" im Blutstrom des Wirts und legen ihre Eier in großer Zahl ab, welche dann zu chronischen Entzündungen führen. Das neue TP B15 (C. Grevelding) sucht auf der Ebene von Signalmolekülen, Signaltransduktion und Geninduktion nach den Faktoren, die vom Männchen ausgehend beim Weibchen die Geschlechtsreifung auslösen. Damit könnten Zielstrukturen für eine Therapie der Bilharziose gefunden werden.

Ein gemeinsames Merkmal vieler Parasiten einschließlich der Protozoen ist die Prozessierung der polycistronischen Primärtranskripte durch trans-Spleißen. Bei dem Erreger der Schlafkrankheit, Trypanosoma brucei, wurde auch cis-Spleißen entdeckt. TP B10 (A. Bindereif) untersucht die Komponenten der verschiedenen snRNP-Komplexe, die das cis- und trans-Spleißen bei T. brucei bewerkstelligen und verfolgt daneben das Ziel, weitere cis-Introns im T. brucei Genom zu identifizieren.

Ein weiteres intrazellulär wachsendes Protozoon ist Plasmodium falciparum, der Erreger der Malaria tropica. TP A12 (K. Becker-Brandenburg) untersucht die Peroxiredoxine als Überlebensfaktoren dieses weltweit vielleicht wichtigsten Erregers, die ihn gegen reaktive Sauerstoffspezies schützen. Die im TP bereits identifizierten und in präparativen Mengen verfügbaren Enzyme sollen nun in ihrer Raumstruktur und im Hinblick auf physiologische Funktionen charakterisiert werden.
Die Räumlichkeiten des SFBs reichen vom normalen biochemischen / molekularbiologischen Labor mit der Sicherheitsstufe S1 oder S2 bis zum Hochsicherheitslabor der Stufe BLS4 in Marburg und in Zukunft bis zur Stufe S4, in Gießen bis Stufe S3.

Ein wichtiges gemeinsames Gerät ist das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop, das im Rahmen von TP B5 (M. Kann) nun in einer neuen leistungsfähigeren Version bewilligt wurde.
Microarrays können von TP B14 (T. Hain, T. Chakraborty) bereitgestellt werden.

Im Zentralprojekt Z1 (R. Geyer, G. Lochnit) wurden schon bislang in bewährter Weise Peptid- und Glykananalysen durchgeführt, zunehmend mit Hilfe moderner MS/MS-Techniken.
In TP Z4 (M. Hardt) wurde ein Hochleistungselektronenmikroskop für den Cryo-Betrieb mit nativen Krankheitserregern bis zur Stufe S2 etabliert. Es steht nun für hochauflösende Strukturuntersuchungen und native Immunelektronenmikroskopie zur Verfügung.
TP Z3 (W. H. Gerlich) verwaltet zentral die Reise- und Publikationskosten, organisiert die externe und interne Seminarreihe des SFB 535, und verwaltet zusammen mit der Finanzabteilung des Fachbereichs Medizin in Gießen die bewilligten Mittel.


 
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