Teilprojekte des SFB 535
Invasionsmechanismen und Replikationsstrategien von Krankheitserregern
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TP A18

Internalisierung und Membranfusion von BVDV


Prof. Dr. Till Rümenapf

Dr. Thomas Krey

Institut für Virologie

Justus-Liebig-Universität, Gießen


Zusammenfassung

Mit der Identifizierung von bovinem CD46 als zellulärem Rezeptor sowie dem Nachweis der endosomalen Internalisierung konnten wir grundsätzliche Aspekte der Aufnahme des Pestivirus BVDV (Bovines Virusdiarrhöe Virus) in die Zielzelle aufklären. Dabei scheint das Virus auf den ersten Blick bewährte Rezeptorstrukturen (CD46) und Mechanismen (Clathrin-abhängige Endozytose gefolgt von pH abhängiger Fusion) zu verwenden, wie sie bereits von einer Reihe behüllter RNA Viren bekannt sind. Bei näherer Betrachtung zeigt sich jedoch, dass die Infektion der Wirtszelle komplexer ist, als es die scheinbare Analogie zu verwandten Viren (Flaviviridae) vermuten lässt. So muss davon ausgegangen werden, dass die Bindung an CD46 alleine nicht für die Infektion ausreicht. Mindestens ein weiteres Molekül, wahrscheinlich ein Korezeptor, ist für die Internalisierung von BVDV erforderlich. Dies ist bemerkenswert, da CD46 ebenfalls Clathrin-abhängig von der Plasmamembran internalisiert wird, also den gleichen Internalisierungsmechanismus benutzt wie das gebundene Virion. BVDV gelangt jedoch nicht als an CD46 gebundener Ligand in die Zelle. Im geplanten Teilprojekt soll insbesondere der Internalisierungsdefekt von BVDV resistenten bovinen Zellen (CRIB Zellen) durch genetische und biochemische Methoden aufgeklärt werden. Im Vordergrund steht dabei das Ziel, die in CRIB Zellen fehlende Funktion durch retroviralen Gentransfer einer cDNA Bank aus MDBK Zellen zu komplementieren. Zum anderen sollen Ergebnisse experimentell verifiziert werden, die eine Interaktion des viralen Glykoproteins E2 nicht nur mit CD46, sondern auch mit dem Corezeptor nahelegen.
Der Analyse des Glykoproteins E2 und des E1E2 Komplexes ist der zweite Themenkomplex des Teilprojekts gewidmet, da E2 neben der Rezeptorbindung vermutlich auch für die Membranfusion verantwortlich ist. Auch hierbei gibt es wichtige Unterschiede zum Flavivirusmodell, denn BVDV ist nicht unmittelbar zur pH abhängigen Fusion fähig. Vielmehr bedarf es eines Aktivierungsschrittes, der BVDV während der Internalisierung als Voraussetzung für die pH abhängige Fusion in einen metastabilen Zustand überführt. Hierbei spielen intra- und intermolekulare Disulfidbrücken zwischen E1 und E2 eine besondere Rolle. Um die verschiedenen Funktionen von E2 und E1E2 besser zu verstehen, soll als übergeordnetes Ziel die dreidimensionale Struktur von E2 bestimmt werden. Unterstützend für die geplante Modellierung des E2 sind verschiedene biochemische Analysen vorgesehen, u.a. Kartierung der Disulfidbrücken, Lokalisierung des Fusionpeptids und Lokalisierung der Rezeptorbindungstelle im E2. Darüber hinaus sind Ansätze zur Kristallisierung und Analyse der Röntgenkristallstruktur von E2 geplant. Insgesamt erwarten wir uns wichtige Fortschritte in der vollständigen Aufklärung des Invasionmechansimus von Pestiviren, was sowohl Rückschlüsse auf die Pathogenese der veterinärmedizinisch wichtigen Infektionskrankheiten „Klassische Schweinepest“ und „Bovine Virusdiarrhöe“ zuläßt, als auch modellhaften Charakter für andere Mitglieder der Virusfamilie Flaviviridae (inbesondere Hepatitis C Virus) haben kann.



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