Teilprojekte des SFB 535
Invasionsmechanismen und Replikationsstrategien von Krankheitserregern
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TP A2

Struktur und Funktion der
Hepatitis B-Virusoberflächenproteine



Prof. W. H. Gerlich

Dr. Dieter Glebe
Institut für Med. Virologie (FB 11), Justus-Liebig-Universität, Gießen

Zusammenfassung

Die für die Infektion notwendigen zellulären Bindeproteine, die Kompartimente der Aufnahme des HBV, sowie der Ort der Fusion und der Freisetzung des Corepartikels in das Zytoplasma der Zielzelle sind trotz jahrzehntelanger Bemühungen vieler Forscher noch nicht bekannt und sollen jetzt identifiziert werden. Neue Lösungsansätze ermöglicht das von uns optimierte Infektionssystem der primären Hepatozytenkulturen von Tupaia belangeri (Ordnung Scandentia, südostasiatische Spitzhörnchen). Dieses Infektionssystem ist homolog zu den schwer verfügbaren primären humanen Hepatozyten, und wegen des hohen Differenzierungsgrads den bestehenden Hepatom-Zelllinien in Effizienz und Aussagekraft für unsere Fragestellung überlegen.

Bindung und Aufnahme des HBV sollen sowohl durch konfokale (B5) und Kryo-Elektronen-Mikroskopie (Z4) mit Hilfe von neuen Instrumenten (B5), als auch durch biochemische Analyse des gesamten Virus oder von Virusbestandteilen nach Zellfraktionierung charakterisiert werden. Im Einzelnen sollen die Aufnahmewege des Virus durch Expression von Schlüsselproteinen der zellulären Aufnahmewege und deren dominant negativen Defektmutanten charakterisiert werden. Weitere Fragestellungen sind die Abhängigkeit der Infektion vom pH-Wert, vom Redoxpotential und eventueller Proteolyse innerhalb charakterisierter Zellkompartimente, sowie die intrazelluläre Lokalisation der Freisetzung des Core-Partikels in das Zytoplasma der Zelle.

Daneben sollen die daran beteiligten Rezeptorstrukturen durch Bindungs- und Crosslinking-Studien genauer bestimmt werden. In der letzten Antragsperiode konnten wir durch den Einsatz von chemisch synthetisierten myristoylierten HBV präS1-Peptiden eine minimale virale Bindesequenz auf der Oberfläche des Virus bestimmen, die für die Infektion essentiell ist. Diese Peptide oder subvirale Partikel sollen nun mit spezifischen Bindemolekülen auf der Oberfläche von Hepatozyten durch den Einsatz von heterologen- oder homo-bifunktionalen Crosslinkern kovalent vernetzt werden. Die Bindung kann dabei an bereits isolierten Hepatozyten in Kultur erfolgen oder nach Applikation der viralen Bindungspart-ner direkt in situ während der Perfusion der Tupaialeber oder einzelner Leberläppchen. Der Nachweis der kovalent gebundenen Proteinkomplexe erfolgt dann biochemisch nach 2D-Gelelektrophorese und tryptischem in-situ-Verdau mittels Massenspektroskopie und HPLC und N-terminaler Mikrosequenzierung in Zusammenarbeit mit Projekt Z1.

Das von uns etablierte Zellkultursystem erlaubt die Messung von HBV-Infektiosität und von neutralisierenden Antikörpern. Es soll daher genutzt werden, um die Infektiosität natürlich aufgetretener Escape-Mutanten und die Schutzwirkung von Antikörpern gegen die mutierten PräS- oder S-Domänen zu untersuchen.


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